问答题λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建 cDNA 文库的高效载体,这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成,它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA 被插入载体的质粒部分,然后它能在体外被包装入病毒颗粒中,包装起来的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌,λYES中的质粒序列能够被诱导重组出λ基因组,并进行独立复制,这就可以从质粒中分离出来,以便进行进一步的遗传操作。       为了最大限度地提高克隆效率,载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶 XhoI(5’-C十 TCGAG)进行切割,然后在 dTTP 存在的情况下,同 DNA 聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链 cDNA 同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来,这两段寡聚核苷酸的序列是:5’—CGAGATTTACC 和5’—GGTAAATC,它们的 5’端都是磷酸。然后将载体和 cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用 2μg的7载体和 0.1μg 的 cDNA,构建了一个有 4×10 个克隆的 cDNA 文库。载体和cDNA分子要经过怎样的处理才能提高产生重组 DNA分子的效率?

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5.问答题

四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小核(微核)含有细胞染色体的主要拷贝,它参与细胞的性接合,而并不在通常的基因表达中起作用。大核(巨核)含有细胞基因组的“工作”拷贝,由大量基因大小的双链 DNA 片段(微染色体)组成,它们活跃地进行着转录。含有核糖体 RNA基因的微染色体拷贝数很多,可以用梯度离心进行分离。在电子显微镜下检查,每一个核糖体微染色体是一种长为 21kb 的线性结构。进行凝胶电泳时,核糖体微染色体的迁移也是 21kb(图 3 的第一泳道)。但是,如果用限制性内切核酸酶BglⅡ切割微染色体,产生的两个片段(13.4kb 和 3.8kb)的总和不等于 21kb(图3的第二泳道),改用其他的限制性内切核酸酶切割,所产生的限制性片段的总和也都小于 21kb,并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。如果把未经切割的微染色体先进行变性和复性处理,然后再进行凝胶电泳,所得到的双链 DNA片段只有 10.5kb(图 3 第三泳道);与此相似的是,将 BglⅡ切割的微染色体进行变性和复性,电泳后,13.4kb的片段被 6.7kb 的片段所取代 (图 3 第四泳道)。请解释为什么限制性片段的总长度不等于 21kb?为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变?对于核糖体微染色体中的总序列组成你有什么看法?