问答题影响酶切反应的因素及产生酶切星号活性的分析。

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5.问答题

打算将一个 cDNA 克隆到一个表达载体,以便在 E.coli 中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA 的两侧具有 BamHI的位点,因此计划将它从 BamHI的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行:载体用 BamHI切割以后,立即用碱性磷酸酶处理除去 5’磷酸;接着将处理过的载体同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA连接酶后进行温育,连接之后,将 DNA 同已处理过的可以接受 DNA的细菌感受态细胞混合。最后,将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因,所以,转化的细菌能够存活。实验中同时设置了 4 个对照: 
对照1:   将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上;       
对照2:   将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照3:   将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照4:   将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用 DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细
菌细胞涂布在培养平板上。  
     在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表 2)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没有菌落生长(表 2)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(表 2)。从实验平板上挑出 12 个菌落,分离了质粒 DNA,并用 BamHI进行切割,其中 9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带,另三个克隆中切出一个cDNA 片段,实验终于获得成功。

为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
6.问答题

打算将一个 cDNA 克隆到一个表达载体,以便在 E.coli 中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA 的两侧具有 BamHI的位点,因此计划将它从 BamHI的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行:载体用 BamHI切割以后,立即用碱性磷酸酶处理除去 5’磷酸;接着将处理过的载体同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA连接酶后进行温育,连接之后,将 DNA 同已处理过的可以接受 DNA的细菌感受态细胞混合。最后,将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因,所以,转化的细菌能够存活。实验中同时设置了 4 个对照: 
对照1:   将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上;       
对照2:   将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照3:   将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照4:   将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用 DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细
菌细胞涂布在培养平板上。  
     在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表 2)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没有菌落生长(表 2)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(表 2)。从实验平板上挑出 12 个菌落,分离了质粒 DNA,并用 BamHI进行切割,其中 9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带,另三个克隆中切出一个cDNA 片段,实验终于获得成功。

对照3 和4 各有什么作用?
7.问答题

打算将一个 cDNA 克隆到一个表达载体,以便在 E.coli 中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA 的两侧具有 BamHI的位点,因此计划将它从 BamHI的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行:载体用 BamHI切割以后,立即用碱性磷酸酶处理除去 5’磷酸;接着将处理过的载体同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA连接酶后进行温育,连接之后,将 DNA 同已处理过的可以接受 DNA的细菌感受态细胞混合。最后,将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因,所以,转化的细菌能够存活。实验中同时设置了 4 个对照: 
对照1:   将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上;       
对照2:   将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照3:   将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照4:   将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用 DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细
菌细胞涂布在培养平板上。  
     在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表 2)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没有菌落生长(表 2)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(表 2)。从实验平板上挑出 12 个菌落,分离了质粒 DNA,并用 BamHI进行切割,其中 9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带,另三个克隆中切出一个cDNA 片段,实验终于获得成功。

影响第二次实验结果的原因是什么?对照2 的作用何在?
8.问答题

打算将一个 cDNA 克隆到一个表达载体,以便在 E.coli 中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA 的两侧具有 BamHI的位点,因此计划将它从 BamHI的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行:载体用 BamHI切割以后,立即用碱性磷酸酶处理除去 5’磷酸;接着将处理过的载体同用 BamHI切割的 cDNA 片段混合,加入 DNA连接酶后进行温育,连接之后,将 DNA 同已处理过的可以接受 DNA的细菌感受态细胞混合。最后,将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因,所以,转化的细菌能够存活。实验中同时设置了 4 个对照: 
对照1:   将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上;       
对照2:   将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照3:   将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上;  
对照4:   将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用 DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细
菌细胞涂布在培养平板上。  
     在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表 2)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没有菌落生长(表 2)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(表 2)。从实验平板上挑出 12 个菌落,分离了质粒 DNA,并用 BamHI进行切割,其中 9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带,另三个克隆中切出一个cDNA 片段,实验终于获得成功。

你如何看待第一次的实验结果?对照 1 的目的是什么?